Після 25 днів статичної інкубації при 28°C лакказа з *Pleurotus ostreatus* NRC620 продемонструвала найвищу активність у середовищі для культивування грибів. Оптимальні значення pH та температури для цього ферменту становили 3,0 та 70°C відповідно. Після 2 годин інкубації при 40°C та 50°C активність ферменту збереглася на рівні 68,33% та 59,61% відповідно. Після 2 годин інкубації в цитрат-фосфатному буфері (pH 7,0) активність ферменту залишалася на рівні 100%. Додавання 10 мМ MgSO₄ та CuSO₄ збільшило активність ферменту приблизно на 21% та 35% відповідно, тоді як NaCl, MnCl₂, KCl та CaCl₂ пригнічували активність ферменту. Використовуючи ABTS як субстрат, кінетичні параметри (Km та Vmax) лаккази *Pleurotus ostreatus* NRC 620 становили 1,99 мМ та 16 217 мкмоль хв−1 Л−1 відповідно. Ферментативна обробка зразків яблучного соку значно знизила як pH, так і в'язкість, і це зниження корелювало зі збільшенням часу зберігання. Обробка лакказою призвела до незначного зниження загального вмісту фенолів у яблучному соку, але зниження антиоксидантної активності не спостерігалося.
В останні роки дослідники зосередилися на застосуванні зеленої біотехнології в харчовій промисловості. Лаказа є одним з найкорисніших ферментів у харчовій промисловості, знаходячи застосування в таких галузях, як переробка соків, випічка, стабілізація вина та покращення органолептичних якостей харчових продуктів.1Багато вищих рослин і мікроорганізмів виділяють лакказу,2а гриби, такі як дейтероміцети, аскоміцети та базидіоміцети, також можуть виробляти лакказу.3Лаказа (EC 1.10.3.2) – це синя оксидаза, яка відновлює молекулярний кисень до води за допомогою системи, що складається з трьох різних атомів міді, тим самим окислюючи різні фенольні сполуки та ароматичні аміни. Під час виробництва фруктових та овочевих соків ферментативне та неферментативне потемніння є критичними проблемами.4Оскільки ці речовини негативно впливають на колір, смак і аромат соку, їх необхідно видалити.5
З усіх фруктів яблука споживаються найбільше у світі та в Європейському Союзі. У 2019 році виробництво яблук посіла третє місце у світі, перевищивши 87 мільйонів тонн.6Яблука містять численні фенольні сполуки, включаючи флавоноїди та фенольні кислоти, такі як кавова кислота та хлорогенова кислота.7Оскільки яблучний сік зазвичай споживають у прозорому вигляді, приблизно від 50% до 90% фенольних компонентів втрачається під час процесу фільтрації.8Сьогодні споживачі схильні обирати мінімально оброблені продукти, такі як каламутний яблучний сік з високим вмістом поліфенолів. Однак через високий вміст фенолів цей вид яблучного соку особливо схильний до зміни кольору та потемніння.9Для зменшення або запобігання потемніння яблучного соку використовуються різні технології, включаючи методи термічної обробки, такі як пастеризація при температурі 60–90°C.10Однак, згідно з дослідженнями Сауседа-Галвеса11Термічна обробка може руйнувати леткі хімічні речовини та впливати на органолептичні якості яблучного соку. Альтернативами методам термічної обробки є надкритичний вуглекислий газ, ультрафіолетове випромінювання, ультразвук, високий гідростатичний тиск або гомогенізація під високим тиском.12Ефективність цих технологій та вихід відповідних фруктових соків залежать від використовуваних параметрів та характеристик продукту. Їхнє широке використання обмежене високою вартістю, негативним впливом на якість деяких харчових продуктів або недостатньою інактивацією ферментів.13,14
Лаказа може бути використана для стабілізації та освітлення фруктового соку.15Гьокмен та ін.16рекомендують використовувати лакказу для освітлення фруктових соків, оскільки вона ефективно видаляє фенольні сполуки, перетворюючи їх на полімери або олігомери, які легко видаляються будь-якою ультрафільтраційною мембраною, що дозволяє яблучному соку зберігати стабільний колір і прозорість до шести тижнів при температурі 50°C. Очищену лакказу *Trichoderma* іммобілізували на кульках оксиду алюмінію та використовували для селективного видалення сторонніх присмаків, спричинених мікробним забрудненням яблучного соку.17
Приблизно 80-90% летких компонентів яблучного соку складають ефіри та альдегіди, які надають соку неповторного аромату.18Лаказу з *Trametes versicolor* іммобілізували на недорогому носії, виготовленому з натурального волокна з молодої шкаралупи кокосових горіхів, для освітлення яблучного соку.19У попередніх дослідженнях вивчали стабілізацію яблучного соку (колір та каламутність) за допомогою безферментних або іммобілізаційних методів, або в поєднанні з ультрафільтрацією.5,19Однак, вплив грибкових лаказ на фізико-хімічні властивості яблучного соку під час зберігання залишається незрозумілим. Тому метою цього дослідження було експериментально дослідити зміни фізико-хімічних властивостей, вмісту фенольних сполук та антиоксидантної активності яблучного соку після обробки грибковими лаказами та двотижневого зберігання в холодильнику. Лакази мають здатність окислювати фенольні сполуки, що робить їх перспективними для використання в різних промислових процесах, включаючи освітлення соку. У цьому дослідженні вивчали лакази з *Pleurotus ostreatus* NRC 620, зосереджуючись на ідеальних умовах для їхньої активності та ефективності в освітленні соку. Хоча дослідження гливи (P. ostreatus NRC 620) все ще обмежені, попередні дослідження вивчали ферменти з різних грибних джерел, таких як Trametes versicolor та Ganoderma lucidum. Метою цього дослідження було оцінити потенційне застосування цього ферменту в харчовій промисловості та виділити його унікальні властивості, зокрема ідеальний pH та температуру.
2,2′-Азооксибіс(3-етилбензотіазолін-6-сульфонову кислоту) (ABTS) було придбано у Sigma-Aldrich (Канада). Всі інші реагенти були аналітичного класу.
Центр колекції мікробних культур Національного дослідницького центру отримав відомий штам гливи звичайної NRC620. Після субкультивування цей штам зберігали на скошених пластинах картопляно-декстрозного агару при температурі 4°C. Метод приготування інокуляту був наступним: 10-денний, повністю розвинений міцелій інокулювали на чашки з картопляно-декстрозним агаром та інкубували при 28°C. Через 10 днів три блоки міцелію діаметром 12 мм видаляли з агарового середовища за допомогою стерильного металевого пробійника та поміщали в колби Ерленмейєра об'ємом 250 мл з ватними пробками, що містили 50 мл стерилізованого культурального середовища (pH 5,0, як описано раніше Отманом та ін.).20). Культури інкубували при 28°C протягом 18 днів. Потім культури фільтрували через фільтрувальний папір Whatman № 1, а отриманий супернатант служив джерелом ферменту.
Активність лакази визначали з використанням ABTS як субстрату. Реакційна суміш (2 мл) містила 500 мкл 0,3 мМ ABTS (розчиненого в 0,1 М буфері цитрату натрію, pH 4,5) та необхідну кількість зразка ферменту, розведеного дистильованою водою.21,22Враховуючи, що лакказа може окислювати ABTS за кімнатної температури (28 °C ± 2), окислення ABTS визначали шляхом вимірювання збільшення поглинання при 420 нм (ε420= 36 000 см-1 M -1) за допомогою УФ-спектрофотометра Agilent Carry-100. Для окислення 1 мкмоль ABTS за хвилину потрібна була одна одиниця лакказної активності. Концентрацію білка визначали методом Бредфорда з використанням бичачого сироваткового альбуміну як внутрішнього контролю.23,24
Після отримання ферменту зі штаму гливи NRC 620, його активність вимірювали з різними інтервалами культивування протягом 25 днів у статичних умовах при 28 °C.
Для вивчення впливу температури на активність лаккази експерименти проводили в діапазоні температур від 20 до 90 °C. Перед додаванням ферменту та початком реакції буфер (0,1 М цитрат натрію, pH 4,5) та субстрат (ABTS) змішували та інкубували протягом 5 хвилин за різних температур. Термостійкість ферменту оцінювали шляхом інкубації в 0,05 М фосфатному буфері натрію (pH 7,0) при 40, 50, 60 та 70 °C протягом 2 годин відповідно. Залишкову активність потім оцінювали за допомогою субстрату ABTS.
Вплив pH на активність лакази оцінювали з використанням ABTS як субстрату в 0,1 М цитрат-фосфатних буферах з діапазоном pH від 2,5 до 7,0. Розчин ферменту інкубували при 40°C протягом двох годин у 0,1 М цитратному та Tris-буферах (pH 3, 4, 6 та 7) для оцінки стабільності pH. Залишкову активність з ABTS як субстратом розраховували після інкубації.
Лаказу інкубували протягом 10 хвилин у натрій-фосфатному буфері (0,05 М, pH 7,0), що містив різні іони металів (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ та Mn2+) у концентраціях 2,5 мМ та 10 мМ відповідно. Потім додавали субстрат (ABTS) для ініціювання реакції та оцінювали відносну активність.
Окислення ABTS лакказою при різних концентраціях (0,025–3 мМ) вимірювали при pH 4,5 для визначення кінетичних параметрів (Vmax та Km).константирівняння Міхаеліса-Ментена розраховували за допомогою графіка Лайнуівера-Берка, який відображає обернену величину швидкості реакції як функцію концентрації субстрату. Кінетичні константи розраховували за графіком Лайнуівера-Берка за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism версії 6.01.
Після ретельного промивання яблук водопровідною водою, їх розрізали навпіл та вичавили сік за допомогою повністю автоматичної соковижималки для яблук Braun MP80 (виготовленої в Німеччині). Сік фільтрували через чотири шари марлі. Контрольній групі ферменти не додавали, тоді як 2,0% лаккази (найефективніша протестована концентрація) додали до свіжоприготованого яблучного соку, який потім зберігали при температурі 4°C протягом двох тижнів.
Титрувану кислотність (TA) та pH визначали за методом Боултона та ін.ал.27. pH кожного зразка вимірювали за допомогою цифрового pH-метра (pH-метр JENWAY 3510). Титрувану кислотність (TA) розраховували на основі яблучної кислоти за наступною формулою.
Де V та C – відповідно об’єм (мл) та концентрація (0,1 моль/л) розчину гідроксиду натрію, що використовується в титруванні. K – коефіцієнт перетворення яблучної кислоти, що дорівнює 0,067, а W – маса (г) яблучного соку.
Загальна кількість розчинних твердих речовин (ТДС) вміст у всіх зразках соку визначали за допомогою кишенькового рефрактометра PAL-1 (ATAGO, Токіо, Японія). Після кожного вимірювання оптичну лінзу промивали деіонізованою водою, і кожен зразок яблучного соку тестували тричі. Значення для кожного зразка розраховували шляхом усереднення трьох вимірювань. Середнє значення ± стандартне відхилення для кожного зразка яблучного соку також розраховували шляхом усереднення цих результатів.
В'язкопружність зразків яблучного соку оцінювали за допомогою ротаційного віскозиметра (RV, Rheotest 2, Німеччина). Зразок поміщали всередину циліндра «S2» віскозиметра. Видима в'язкість представляли нахилом кривої залежності напруження зсуву від швидкості зсуву, яку розраховували на основі напруження зсуву та відповідних кривих при різних швидкостях зсуву (від 1,00 до 437,4 с⁻¹). Формула для розрахунку видимої в'язкості така:
Де η – видима в'язкість (сП), τ – напруження зсуву (дин/см²), γ – швидкість зсуву (с⁻¹), а (τ) розраховується за допомогою значень крутного моменту (α) та циліндра (Z) за такою формулою: τ = Z . α.
Індекс потемніння визначали за методом Мейдава та ін.ал.2910-мл зразок соку центрифугували при 2750 x g протягом 10 хвилин. 5 мл супернатанту соку змішували з 5 мл 95% етанолу. Поглинання суміші вимірювали при 420 нм за допомогою УФ-спектрофотометра Shimadzu (UV-1601 PC).
Загальний вміст фенолів (ЗВФ) визначали колориметрично за допомогою реактиву Фоліна-Чокальтеу, як описано Боултоном та ін.[27]]. Стандартну криву галової кислоти було побудовано для концентрацій від 0 до 500 мг/л (r²= 0,997). Результати виражені в еквівалентах галової кислоти (мг GAE/мл).
Додайте 125 мкл дистильованої води та 2850 мкл розчину FRAP до 25 мкл яблучного соку та залиште суміш у темряві на30хв. Потім виміряйте поглинання при 593 нм за допомогою УФ-спектрофотометра Shimadzu (UV-1601 PC). Реагент FRAP готували шляхом змішування 300 мМ ацетатного буфера (pH 3,6), 20 мМ хлориду заліза(III) та 10 мМ 2,4,6-трис(2-піридил)триазину (TPTZ) (розчиненого у 40 мМ HCl) у співвідношенні 10:1:1. Стандартну криву побудували з використанням тролокс як стандарту (R²= 0,999), а результати виражені в мкМ тролокс/мл.
Антиоксидантну активність оброблених та необроблених соків визначали за допомогою методу DPPH для оцінки їхньої здатності поглинати вільні радикали DPPH.31Десять мікролітрів соку змішували з 1 мл розчину DPPH (100 мкМ) у метанолі. Після реакції в темряві протягом 30 хвилин поглинання суміші вимірювали при 517 нм за допомогою УФ-спектрофотометра Shimadzu (UV-1601 PC). Результати виражали в еквівалентах тролоксу (мкМ тролоксу/мл) на основі калібрувальної кривої (R2= 0,990).
Отримані дані показали, що максимальне утворення лакази спостерігалося у гливах NRC 620 до кінця 18-го дня ферментації, досягаючи активності 1302 од/л. Це послужило основою для визначення оптимального часу культивування для утворення лакази (Рисунок 1). Хоча утворення ферментів збільшувалося зі збільшенням часу культивування, швидкість зростання не була прямо пропорційною часу культивування; після 21 дня активність ферментів збільшилася лише на 90 од/л (до 1390 од/л). Тому 18 днів було остаточно обрано оптимальним часом культивування, щоб збалансувати вихід продукту з економічними перевагами збільшення часу культивування.
Вплив часу культивування на вихід лакази в Pleurotus ostreatus NRC 620. Три (12 мм) блоки грибкового міцелію інокулювали в 50 мл стерильного середовища, а потім культивували при 28 °C протягом різного часу.
Відповідно до інших досліджень, наші результати показують, що ідеальний період культивування для досягнення пікової секреції лакази грибами, ймовірно, становить від 7 до 36 днів.32За даними Езіке та ін.33, *Trametes polyzona* WRF03 продукував найбільшу кількість лаккази до кінця дев'ятого дня ферментації, з питомою активністю 1637 U/мг білка. Крім того, Отман та ін.34виявили, що *Trichoderma harzianum* S7113 секретувала велику кількість лакази на п'ятий день культивування. Швидкість продукції лакази досягла пікової активності на чотирнадцятий день, а потім поступово знижувалася.34Хоча секреція ферментів може відбуватися також під час основної фази росту, вона зазвичай досягає піку протягом проміжної фази та запускається споживанням джерела вуглецю або азоту.34,35
Хоча лакказа з Pleurotus ostreatus NRC 620 демонструвала високу активність у широкому діапазоні температур від 50°C до 80°C, наближаючись до пікової активності (69–98%), її максимальна активність спостерігалася при 70°C (рис. 2a). Поза цим температурним діапазоном активність ферменту знижувалася приблизно при 70°C. Ці результати свідчать про те, що фермент активний при високих температурах, ймовірно, тому, що висока температура збільшує кінетичну енергію реакції.
Вплив температури реакції (a) та pH (b) на активність лакази в *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Температури в діапазоні від 20 до 90 °C досягали шляхом попередньої інкубації суміші при різних температурах протягом 5 хвилин перед додаванням ферменту та початком реакції. Вплив pH на активність лакази оцінювали за допомогою ABTS як субстрату в розчинах, що містять 0,1 М цитрат-фосфатний буфер у діапазоні pH від 2,5 до 7,0.
Згідно з Езіке та ін.ал.33, оптимальна температура для лаккази *Trametes polyzona* WRF03 становить 55 °C, що дорівнює температурі для *Ganoderma lucidum*.лаккас36та подібна до оптимальної температури (50 °C) для *Trametes polyzona* KU-RNW02737лакказ . Балдріан38зазначає, що, як і для інших ферментних систем, що розкладають лігнін, ідеальний температурний діапазон для лакази становить від 50 до 70 °C.
Результати показали, що фермент проявляв найвищу активність при pH 3,0, досягаючи 94% активності при pH 3,5. Однак він залишався активним у широкому діапазоні pH від 2,5 до 7,0 (Рисунок 2b). Крім того, він проявляв вищу активність у кислих умовах порівняно з нейтральними або лужними. Його активність залишалася щонайменше 77% у діапазоні pH від 2,5 до 4,5, але досягала лише приблизно 38% при pH 7,0. Оптимальне значення pH для лаккази з *Trametes polyzona* WRF03 становило 4,533, що дорівнює pH для лакказ з *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 та *Trametes hirsuta* 41. Однак, згідно з дослідженням Чаїріна та ін.42, оптимальний pH для лакази з *Polymorpha f. sp.* WR710-1 становить 2,2, тоді як оптимальний pH для лакази з *Polymorpha f. sp.* IBL-04 становить 5,043. Зв'язування гідроксид-аніонів (інгібітор лакази) з атомами міді лакази T2/T3 може бути причиною зниження активності лакази в умовах нейтрального або лужного pH. Це може порушити внутрішній перенос електронів з центру T1 до центру T2/T3, тим самимобмеженняактивність ферменту23,44
Інкубуючи фермент за різних температур, було виявлено, що як час інкубації, так і температура впливають на стабільність ферменту. Примітно, що лакказа з *Trametes polyzona* NRC 620 демонструвала вищу стабільність при 40℃ та 50℃, зберігаючи 68,33% та 59,61% своєї початкової активності відповідно через 120 хвилин (Рисунок 3a). Натомість, за тих самих умов (40℃ та 50℃, 120 хвилин), лакказа з *Trametes polyzona* WRF03 зберігала 64,38% та 42,92% своєї активності відповідно.33Навпаки, збільшення часу інкубації та температури знизило стабільність лаккази *Trametes polyzona* NRC 620; після інкубації при 60℃ та 70℃ протягом 60 хвилин її активність знизилася до 39,24% та 1,72% відповідно (Рисунок 3a). Відповідно до експериментальних результатів, лакказа з *Trametes polyzona* WRF03 продемонструвала вищу стабільність при 40 та 50℃ протягом усього процесу термічної обробки.33Аналогічно, Луанджароенкіт та ін.ал.37та Голова та ін.ал.42повідомляли про стабільність лакказ з Trametes polyzona KURNW027 та Trametes polyzona WR710-1 при 50 °C протягом 1 години відповідно. Як корисний біокаталізатор, що застосовується в різних біотехнологічних галузях, лакказа повинна мати хорошу стабільність та продуктивність у широкому діапазоні температур.
Термостатична стабільність (a) та pH-стабільність (b) лаккази з *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Термостатичну стабільність оцінювали шляхом інкубації розчину ферменту в 0,05 М натрій-фосфатному буфері (pH 7,0) при 40, 50, 60 та 70 °C протягом 2 годин відповідно. pH-стабільність оцінювали шляхом інкубації розчину ферменту в 0,1 М цитратному буфері та Tris-буфері (pH 3, 4, 6 та 7) при 40 °C протягом 2 годин. Залишкову активність розраховували з використанням ABTS як субстрату після інкубації.
Щоб визначити оптимальні умови використання та зберігання ферменту, ми дослідили вплив pH на стабільність лаккази. Вплив різних значень pH суттєво впливав на стабільність структури білка, тим самим впливаючи на стабільність та активність молекули ферменту. Результати показали, що фермент був менш стабільним у кислих умовах, тоді як він демонстрував кращу стабільність при вищих значеннях pH (нейтральна та лужна області). При значеннях pH 7,0, 6,0, 4,0 та 3,0 швидкість утримання ферменту через 120 хвилин становила приблизно 100%, 62,54%, 52,39% та 11,14% відповідно (рис. 3b). Лаказа *Strombus multisus* WRF03 показала вищу стабільність при нейтральних значеннях pH (5,5–6,5) та нижчу стабільність при кислих значеннях pH (нижче 4,0). Після 120 хвилин при значеннях pH 5,5, 6,0 та 6,5 коефіцієнти утримання ферментів становили приблизно 82%, 100% та 93% відповідно.33Хайрін та ін.42зазначили, що лакказа з Trametes polyzona WR710-1 була стабільною в діапазоні pH від 6,0 до 7,0, тоді як Сайєд та ін.45показали, що лакказа була більш стабільною в умовах нейтрального pH. Однак, лакказа з Cerrena unicolor також продемонструвала стабільність у лужних умовах (pH 9,0).46Досліджені лаккази продемонстрували високу стабільність у широкому діапазоні pH. Це може бути важливою характеристикою для промислового застосування.
Оскільки деякі іони металів мають як стимулюючий, так і інгібуючий вплив на активність ферментів, їх вплив на активність ферментів необхідно враховувати в промисловому застосуванні. Це має вирішальне значення, оскільки іони металів є поширеними забруднювачами навколишнього середовища, які можуть впливати на стабільність та синтез позаклітинних ферментів.47Щоб дослідити вплив кількох іонів металів на лакказу з *Pleurotus ostreatus* NRC 620, ми провели відповідні експерименти. Як показано на рисунку 4, залежно від типу використаного металу, збільшення концентрації іонів металу від 2,5 мМ до 10 мМ негативно впливало на функцію ферменту. Наприклад,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, таCu²⁺може стимулювати та активувати активність ферментів, водночасНа⁺ , Мн²⁺ , Ca²⁺, таК⁺міг пригнічувати активність ферменту. При концентрації 10 мМ іони Cu²⁺ та Mg²⁺ були найпотужнішими активаторами лакказної активності з *Pleurotus ostreatus* NRC 620, забезпечуючи ступінь активації приблизно 34% та 20% відповідно. Однак, при концентрації 10 мМ, іони Ca²⁺ були найпотужнішим інгібітором лаккази, знижуючи активність ферменту приблизно на 60%.
Вплив іонів металів на активність лакази Pleurotus ostreatus NRC 620. Лаказу інкубували протягом 10 хвилин у натрій-фосфатному буфері (0,05 М, pH 7,0), що містив різні іони металів у концентраціях 2,5 мМ та 10 мМ. Потім реакцію ініціювали додаванням субстрату (ABTS), після чого вимірювали відносну активність.
Наші результати узгоджуються з результатами інших авторів, які виявили, що Mg²⁺ та Cu²⁺ посилюють активність *Trametes polyzona* WRF03³. Кастаньо та ін.⁴⁸ виявили, що лакказа з *Xylaria* sp. певною мірою стимулюється іонами міді (Cu²⁺). Крім того, Форутанфар та ін.⁴⁹ та Сі та ін.⁵⁰ провели аналогічні дослідження лакказ з *Paraconiothyrium variabile* та *Trametes pubescens* відповідно. Сайт зв'язування міді II типу (T2) цього ферменту може бути насичений Cu²⁺ при заданій концентрації, що може пояснити стимуляцію активності лакази при вищих концентраціях Cu²⁺³⁹. Оскільки лаккази грибів білої гнилі є оксидазами, що містять кілька атомів міді, вплив іонів міді на активність лаккази різноманітний і варіюється від стимулюючого та інгібуючого до нейтрального.⁵¹ На противагу цьому, Zhou et al.[52]повідомив, щоCu²⁺пригнічував лакказну активність тайванського підземного терміта (Odontotermes formosanus). Однак лаккази Cerena sp. HYB07[53]та Clitocybe maxima[54]не зазнали впливу іонів міді.
Специфічність субстрату була представлена його кінетичними параметрами (Km та Vmax); чим сильніша спорідненість зв'язування субстрату з ферментом, тим нижче значення Km і вища специфічність субстрату.3,21,55Кінетичні параметри (Km та Vmax) лакази з *Pleurotus ostreatus* NRC 620 були визначені за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 6.0 шляхом побудови графіка Lineweaver-Burk (Рисунок 5). При використанні ABTS як субстрату результати склали 1,99 мМ та 16217 мкмоль.хв⁻¹ Л⁻¹,відповідно. Елсаєд та ін.21повідомляли, що значення Km для окислення ABTS становили 0,1 мМ та 0,064 мМ відповідно, що вказує на високу спорідненість ізоферментів Lac A та Lac B до ABTS. Крім того, значення Vmax становили 0,182 мкмоль.хв⁻¹та 0,603 мкмольхв⁻¹відповідно. Отримане значення Km було нижчим, ніж у Trametes polyzona WRF03 (8,66 мМ); крім того, їхнє значення Vmax (1429 ммоль/хв⁻¹) також булонижчийпри використанні ABTS як субстрату.33 Аналогічно, значення Km концентрацій лаккази Lentinus squarrosulus MR13 та Trametes sp. AH28-2 становили 0,0714 мМ та 0,025 мМ відповідно, а значення Vmax становили 0,0091 мМ хв−1 та 0,67 мМ хв−1 мг−1 (відносно ABTS).відповідно.56,57
Було досліджено вплив концентрації ABTS на активність лакази з *Pleurotus ostreatus* NRC 620, і було побудовано графік Лайнуівера-Берка оберненої залежності початкової швидкості реакції від концентрації ABTS. Реакцію окислення ABTS з різними концентраціями (0,025–3,0 мМ) лакази вимірювали при pH 4,5 для визначення кінетичних параметрів (Vmax та Km). Кінетичні константи Міхаеліса-Ментена розраховували за допомогою графіка Лайнуівера-Берка оберненої залежності швидкості реакції від концентрації субстрату. Кінетичні константи розраховували за графіком Лайнуівера-Берка за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 6.01.
Традиційні освітлювальні ферменти, такі як пектинази, гідролізують пектинові речовини, зменшуючи в'язкість та каламутність. Вони ефективно розщеплюють структурні полісахариди та часто використовуються в поєднанні з іншими ферментами, такими як целюлази та геміцелюлази, для покращення виходу та прозорості. Однак, пектинази не цілеспрямовано впливають на фенольні сполуки, які є основними факторами помутніння та окисного потемніння, особливо в соках, таких як яблучний та виноградний.58На відміну від цього, лаккази каталізують окислення фенольних сполук, полімеризуючи їх у більші, нерозчинні молекули, які можна видалити шляхом седиментації або фільтрації. Цей механізм не тільки покращує прозорість, але й подовжує термін зберігання соку, зменшуючи ймовірність окислювального потемніння, спричиненого фенольними сполуками. Крім того, процеси освітлення на основі лакказ можна проводити за м’яких умов обробки (pH 3,5–5,5, температура 25–40 °C), що робить їх придатними для ніжних соків без шкоди для їхніх харчових чи органолептичних властивостей.59Дослідження показали, що обробка пектиназою може освітлити сік за 1–2 години, тоді як обробка лакказою зазвичай вимагає тривалішого часу реакції (3–6 годин) для повного відновлення фенольних сполук. Однак цей процес можна оптимізувати шляхом іммобілізації ферменту або поєднання лаккази з механічними методами освітлення.60У цьому дослідженні ферментативний аналіз неочищеного екстракту виявив значну активність лакази та α-амілази, тоді як активність пектинази та ксиланази була надзвичайно низькою, а активність целюлази не виявлена. Отже, зниження каламутності та вмісту фенолів було зумовлене головним чином дією лакази, тоді як зміна в'язкості може бути частково зумовлена дією амілази.
У таблиці 1 наведено фізико-хімічні параметри свіжовичавленого яблучного соку та зразків, оброблених лакказою. Результати показали, що вихід свіжовичавленого яблучного соку (71,59%) був нижчим, ніж у зразків, оброблених лакказою (87,34%). Ці результати узгоджуються з висновками Пільника та Оранджа.61, який зазначив, що використання ферментів у переробці фруктів може збільшити вихід соку, покращити фільтрацію та отримати високоякісний, прозорий сік для концентрування. Збільшення виходу соку головним чином зумовлене збільшенням вмісту розчинних цукрів у соку. Під час ферментативного гідролізу фруктів мезоглея та пектин у клітинних стінках продукту руйнуються та перетворюються на розчинні речовини, такі як нейтральні цукри та кислоти.62.Значення pH яблучного соку, обробленого ферментами, було значно нижчим, ніж у контрольній групі (P < 0,05), а значення pH обох груп значно збільшилося під час зберігання (Таблиця 1). Ці результати узгоджуються з результатами Марка та ін.63, який зазначив, що pH соку плодів кеш'ю знизився після зберігання після термічної обробки. Деградація пектину та утворення галактуронової кислоти після обробки ферментами можуть бути причиною підвищення pH під час зберігання. pH зразків, оброблених ферментами, залишався між 4,05 та 4,31 протягом усього зберігання, тоді як pH необробленого яблучного соку коливався між 4,12 та 4,33.
Загальна кислотність (ЗК) як необроблених, так і оброблених лакказою зразків демонструвала тенденцію до зниження зі збільшенням часу зберігання (Таблиця 1). Зниження кислотності пояснюється перетворенням органічних кислот на вуглеводи або ферментативними реакціями, а також окисленням під час зберігання соку.64Загальна кислотність контрольного яблучного соку та зразків, оброблених ферментами, була нижчою, ніж у інших соків (полуничний 0,9%, сливовий 2,2%, кумкватовий 1,0%, абрикосовий 2,4%, апельсиновий 0,8%), але подібною до інших соків (наприклад, грушевий 0,3%).62Ці відмінності в необробленому свіжовичавленому яблучному соку можуть бути зумовлені різними факторами, такими як умови вирощування, генетичні фактори, рівень зрілості та методи обробки.65Зниження загальної кислотності контрольного та обробленого лакказою яблучного соку узгоджується з результатами, представленими Сінгхом та ін.66щодо зниження загальної кислотності яблучного соку Цзінь Нуо після 74 днів зберігання. З іншого боку, Ошмянський та Войдило67не виявили жодних суттєвих змін кислотності яблучного соку при вивченні впливу традиційних методів освітлення.
Результати, представлені в таблиці 1, показують, що значення загального вмісту розчинних речовин (ЗРЗ) у яблучному соку, обробленому лакказою, було вищим, ніж у необробленому зразку. Ці результати узгоджуються з опублікованими дослідженнями.68Крім того, у таблиці 1 показано, що значення загальної концентрації жиру (TSS) контрольної групи яблучного соку становило 9,58 на початку часу та досягло 11,05 до кінця періоду зберігання. Ці значення нижчі за значення TSS свіжого яблучного соку, про які повідомляли Хамід та ін.69(11,2 та 11,80 відповідно). Значення загальної розчинної речовини (ЗРВ) зразків яблучного соку, обробленого лакказою, значно збільшилося, починаючи з 11,23 та досягаючи 12,93 після двох тижнів зберігання при 4°C (Таблиця 1). Подібне збільшення ЗРВ під час зберігання також спостерігалося у цитрусових, лимонах та солодких апельсинах. Збільшення загальної розчинної речовини (ЗРВ) під час зберігання може бути пов'язане з гідролізом полісахаридів (крохмалю) до моносахаридів (цукрів), збільшенням концентрації внаслідок зневоднення соку та розпадом пектину в соку до розчинних речовин. Збільшення загальної розчинної речовини (ЗРВ), ймовірно, пов'язане зі збільшенням розчинних цукрів, які можуть утворюватися в результаті перетворення пектину або целюлози на розчинні цукри пектином або целюлазою відповідно, або в результаті гідролізу крохмалю до цукрів, як повідомляли Хамед та ін.69.Вплив лаккази на властивості яблучного соку можна спостерігати візуально, оскільки яблучний сік, оброблений лакказою, демонструє кращу плинність і нижчу в'язкість, ніж необроблений сік. Це спостереження записано в таблиці 1; В'язкість зразка, обробленого ферментом, становила 1,87 сП, тоді як в'язкість контрольного зразка становила 2,95 сП. Це значне зниження в'язкості, ймовірно, пов'язане з вищою вологоутримуючою здатністю пектиноподібних речовин та утворенням когезивної сітчастої структури.
У цьому дослідженні вплив лаккази на індекс побуріння (ІП) яблучного соку досліджували шляхом вимірювання поглинання при 420 нм за допомогою спектрофотометра. Результати наведено в таблиці 1. Під час зберігання ІП зразків яблучного соку як в обробленій, так і в необробленій групах демонстрував поступову тенденцію до зростання. ІП відображає ступінь побуріння та може служити якважливийіндикатор ферментативних та неферментативних реакцій побуріння. Поглинання значно зростало під час зберігання (P < 0,05). В кінці зберіганняА420Значення зразків яблучного соку в контрольній та ферментативно обробленій групах збільшилося приблизно на 217% та 121% відповідно (Таблиця 1). Результати показують, що ферментна обробка може ефективно зменшити ступінь потемніння приблизно на 56%. Результати Безерри та ін.[19]] узгоджуються з нашими результатами; Вони використовували лакказо-глутаральдегід-кокосове волокно для освітлення яблучного соку, зменшивши його початковий колір на 61%.
Хоча поліфеноли у фруктових соках мають позитивний харчовий та терапевтичний вплив на організм людини, вони також можуть реагувати з білками, викликаючи помутніння соку, осадження або каламутність, тим самим змінюючи смак та аромат продукту та скорочуючи термін його придатності.71Метою цього дослідження було безпечне зниження вмісту фенольних сполук у яблучному соку за допомогою лакази з Pleurotus ostreatus NRC 620. Результати, представлені в таблиці 1, показують, що загальний вміст фенольних сполук у яблучному соку, обробленому лакказою, значно знизився перед зберіганням при 4 °C. Крім того, загальний вміст фенольних сполук також зменшився під час зберігання в обох досліджених зразках (таблиця 1). Дослідження Сандрі та ін.72показали, що оброблений ферментами яблучний сік може зберігати свою антиоксидантну активність та вміст фенольних сполук. Однак результати дослідження Леттера та ін.73показують, що обробка апельсинового соку грибковою лаказою може зменшити вміст фенольних сполук у ньому до 45%.
Було показано, що фенольні сполуки мають такі властивості, як поглинання вільних радикалів, відновлення та гасіння синглетного кисню, перенесення атомів водню та донорство електронів вільним радикалам, що робить їх потужними антиоксидантами.74Тому в цьому дослідженні для оцінки впливу лаккази на антиоксидантну активність яблучного соку, що зберігався в холодильнику протягом 14 днів (Таблиця 2), були використані методи на основі DPPH та FRAP. Обидва методи показали підвищення антиоксидантної активності під час зберігання, що може бути пов'язано зі збільшенням вмісту вільних фенольних сполук або утворенням продуктів реакції Майяра (MRP), причому продукти реакції Майяра, ймовірно, є причиною підвищення антиоксидантної активності.75Неферментативні реакції побуріння (включаючи деградацію аскорбінової кислоти, реакції Майяра та кислотно-каталізовану деградацію цукрів) призводять до утворення коричневих пігментів (меланоїдинів). Проміжні продукти деградації аскорбінової кислоти та продукти деградації цукру (такі як карбонільні сполуки) можуть реагувати з амінокислотами через реакції Майяра.76Хоча потемніння фруктів та овочів під час зберігання було ретельно вивчено, наше розуміння цих реакцій залишається обмеженим.77Порівняно з методом FRAP, яблучний сік, оброблений лакказою, показав значно нижчу антиоксидантну активність за методом DPPH (таблиця 2), а антиоксидантна активність усіх зразків значно зростала зі збільшенням часу зберігання. У цьому дослідженні було використано два різні методи визначення антиоксидантної активності, оскільки їхні принципи відрізняються. Метод DPPH вимірює здатність нейтралізувати вільні радикали, тоді як метод FRAP вимірює здатність відновлювати іони заліза. Тому рекомендується використовувати кілька методів визначення антиоксидантної активності, щоб краще зрозуміти антиоксидантну активність досліджуваних зразків.78
Одним з ключових висновків цього дослідження є те, що лакказа *Pleurotus ostreatus* NRC 620 демонструє оптимальну активність при 70°C та pH 3,0. Порівняно з іншими грибковими лакказами, що зазвичай використовуються для освітлення соку, такими як лаккази *Trametes versicolor* та *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 демонструє вищу термостабільність та більш кислий pH. Лакази з *Trametes versicolor* та *Ganoderma lucidum* зазвичай демонструють оптимальну активність у діапазоні 50-60°C та при значеннях pH від 3,5 до 5,0. Ця різниця може сприяти покращенню ефективності освітлення соку, особливо для кислих соків, де стабільність при нижчих значеннях pH є критично важливою. Унікальна характеристика *P. Порівняно з іншими дослідженими грибковими лакказами, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 демонструє здатність ефективно функціонувати в більш складних умовах. Його вища оптимальна температура активності свідчить про потенційні переваги в промисловому застосуванні, такі як вища швидкість реакції та зниження мікробного забруднення. Його низький pH, який добре підходить для кислої природи багатьох соків, може бути корисним у процесах освітлення соків. Ці результати виправдовують подальші дослідження для широкомасштабного застосування, що робить *Pleurotus ostreatus* NRC 620 життєздатною альтернативою традиційним джерелам грибкової лакази. Порівняно з попередніми дослідженнями, ми виявили, що оптимальна температура становить 60°C, а оптимальний pH – 3,0. Після реакції при 60°C протягом 80 хвилин лакказа *Ganoderma lucidum* зберігалася.46% від його активності.79 За даними Курніаваті та Нісель80Ферменти *Ganoderma lucidum* демонструють відмінну та помірну стабільність при температурі 25°C та значеннях pH від 5,0 до 8,0, а також стабільність при pH 6,0 та температурах від 10 до 30°C. У цьому дослідженні ми виявили, що оптимальні значення pH та температура для активності ферменту *Pleurotus ostreatus* становили 3,0 та 70°C відповідно. Після інкубації при 40°C та 50°C протягом двох годин фермент зберіг 68,33% та 59,61% своєї активності відповідно. Крім того, лакказа Pleurotus ostreatus NRC 620 демонструвала високу активність у широкому діапазоні температур від 50°C до 80°C, майже досягаючи максимальної активності (69%–98%), причому максимальна активність спостерігалася при 70°C.
На завершення, лакказа NRC620 гливи гливи, отримана за статичних умов, продемонструвала оптимальну активність та стабільність у різних умовах pH та температури, демонструючи кращу стабільність порівняно з іншими джерелами ферментів. Додавання 10 мМ MgSO₄ та CuSO₄ збільшило активність ферменту приблизно на 21% та 35% відповідно. При переробці на яблучний сік фермент знижував pH та в'язкість, тоді як вміст фенолів зменшувався лише незначно під час зберігання.
Результати підтверджують потенціал лаккази в харчовій промисловості, зокрема для освітлення напоїв. Спеціально розщеплюючи фенольні сполуки, лакказа не тільки зменшує каламутність і покращує прозорість, але й підтримує якість фруктових соків за м'яких умов експлуатації. На відміну від традиційних освітлювачів, таких як желатин, бентоніт і силікагель, лакказа не утворює відходів і не видаляє приємні аромати з напоїв, що робить її більш екологічно чистим та сталим варіантом. Крім того, порівняно з іншими ферментами та методами фільтрації, лакказа пропонує цілеспрямоване та економічно ефективне рішення без шкоди для якості продукту.
Кьомухімбо, Г.Д. та Брінк, Х.Г. Застосування та стратегії іммобілізації мідьвмісних лакказ; огляд. Heliyon 9, e13156 (2023).
Час публікації: 15 грудня 2025 р.